Trong quá trình xúc tác của enzym vùng cấu trúc không gian đặc biệt tham gia trực tiếp vào phản ứng để kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động".
Cấu tạo đặc biệt của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác của enzym.
Trong "enzym 1 cấu tử", các acid amin thường phân bố trên những phần khác nhau của mạch polypeptid nhưng nằm kề nhau trong không gian tạo thành trung tâm hoạt động. Sự kết hợp của các nhóm chức của các acid amin, thường gặp là -SH của cysteine, -OH của serine, vòng imidazol của histidine, w-COOH của aspartie và acid glutamic, -COOH của các acid amin cuối mạch...
Trong "enzym hai cấu tử" ngoài mạch polypeptid mà các nhóm chức kết hợp để tạo trung tâm hoạt động, còn có các nhóm chức coenzym và các nhóm ngoại khác kết hợp tạo thành trung tâm hoạt động
Ở enzym chứa kim loại, các ion kim loại cũng tham gia vào việc tạo trung tâm hoạt động
Trong các nhóm chức tham gia tạo trung tâm hoạt động cần phân biệt hai nhóm: "tâm xúc tác" (tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác của enzym) và "nền tiếp xúc" (giúp enzym kết hợp đặc hiệu với cơ chất)
Một enzym có thể có 2 hoặc nhiều trung tâm hoạt động, tác dụng của các trung tâm hoạt động không phụ thuộc vào nhau.
Các cơ chất kết hợp với trung tâm hoạt động tạo phức hợp enzym-cơ chất (ES)
E + S → ES->ES++ → E + PS:cơ chấtP:sản phẩm
Yêu cầu: E và S phải bổ sung về mặt không gian và hợp nhau về mặt hóa học, có khả năng hình thành nhiều liên kết yếu với nhau. Chúng liên kết sao cho có thể tạo ra và cắt đứt sự dính nhau được gây nên do biến động nhiệt ngẫu nhiên ở nhiệt độ thường.
Trong một số enzym còn có "trung tâm dị không gian" - những phần enzym khi kết hợp với các chất có phân tử nhỏ nào đó sẽ làm biến đổi cấu trúc bậc ba của toàn bộ phân tử enzym làm cấu trúc trung tâm hoạt động thay đổi → biển đổi hoạt tính của enzym.
